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　　01

 

　　PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤，這大多是由于聚合酶忠實(shí)性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時(shí)需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時(shí)降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會(huì)出現(xiàn)該問題，此時(shí)應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。

 

　　02

 

　　ABI7500熒光定量PCR儀目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析，因?yàn)橐鹪搯栴}的可能很多。可先檢查是否模板質(zhì)量問題，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時(shí)有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時(shí)間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時(shí)電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對具體原因再采取相應(yīng)的措施。

 

　　03

 

　　PCR產(chǎn)物何時(shí)需要用凝膠純化，何時(shí)不需要？當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時(shí)，則不需要使用凝膠純化。當(dāng)可見其他雜帶時(shí)，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。

 

　　04

 

　　如果實(shí)驗(yàn)中沒有回收到目的片段，則需要繼續(xù)進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。包括涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞，按照的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

 

　　05

 

　　實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增該怎么辦？這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染的表現(xiàn)，應(yīng)通過檢查排除污染源。先考慮是否為試劑污染，可將試劑分裝好直接置于PCR儀中擴(kuò)增進(jìn)行判斷。其次要考慮是否為實(shí)驗(yàn)室污染，可更換所用的移液器、吸咀管（離心管）等，將試驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中，判斷是否為實(shí)驗(yàn)室污染。如果是則需要對整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材*清洗處理，保持良好的通風(fēng)、清潔等。此外，還要考慮是否為采樣污染，一般表現(xiàn)為一批結(jié)果陽性率很高，一批結(jié)果陽性率又下降很多，如此反復(fù)。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣。

 

　　06

 

　　實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性擴(kuò)增該怎么辦？先要考慮是否為儀器故障，ABI7500熒光定量PCR儀儀器應(yīng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，尤其要注意加熱溫度及各管間的差異是否符合實(shí)驗(yàn)要求，是否出現(xiàn)誤差等。其次要考慮是否為試劑失效或無效引起，使用有效的試劑。